影響凝膠過濾分離效果的主要因素

今天主要介紹下影響其分離效果的主要因素：

流速對分離效果的影響較大，所以在洗脫分離蛋白質(zhì)樣品時保持合適而恒定的流速非常重要。凝膠色譜系統(tǒng)中洗脫流速主要取決于凝膠柱的內(nèi)徑和高度、凝膠種類、顆粒大小以及分離類型等。一般在開始正式洗脫之前，先要進行預(yù)備試驗以確定合適的流速。較緩的流速可使蛋白樣品與凝膠基質(zhì)充分平衡，達到理想的分離效果，但是流速過低會造成樣品在凝膠床內(nèi)的橫向擴散增大，使峰寬變寬，降低分辨率。此外，還延長了洗脫時間，降低工作效率。高流速易引起洗脫峰的重疊，使本來可分開的組分重合，而且會增大柱壓，影響分離效果。一般凝膠的線性流速控制在2-10cm/h。商品凝膠出廠時，商家提供的一些流速參數(shù)可供使用者參考。在一般實驗中通常用蠕動泵調(diào)節(jié)流速，沒有條件的可通過控制一定的高度壓差來控制流速。在實驗中通常使用體積流速 （mL/min），有時為了實驗需要，還需將體積流速轉(zhuǎn)換成線性流速（cm/h），其轉(zhuǎn)換公式如下：

加樣體積 （Vs）也可對蛋白樣品的分離效果造成較大的影響。體積過大，會造成平臺洗脫峰或相鄰峰的重疊，影響分離效果；加樣過少，目的蛋白組分的收集量少、稀釋倍數(shù)增大、濃度低，降低實驗效率。

樣品進樣前應(yīng)高度濃縮，但是濃度不可過大，否則會影響分離效果。蛋白質(zhì)濃度應(yīng)小于70mg/mL，一般在10-20mg/mL。必要時，需進行樣品濃度系列試驗，以確定zuijia值。過低的樣品濃度可造成某一蛋白組分的過度稀釋，影響收集；而濃度過高時會使流動相不穩(wěn)定，造成洗脫峰的變形或重疊。此外，樣品濃度還和分離純化的類型有關(guān)，進行蛋白組別分離或脫鹽除雜時，由于目的蛋白和雜質(zhì)的分子量差異較大，故可適當(dāng)提高樣品濃度，而進行分子量差異較小的分級分離或分析性實驗時，樣品濃度盡量要低一些。

樣品洗脫液中含有一定離子強度的鹽溶液可防止蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與凝膠介質(zhì)之間的相互作用，排除蛋白質(zhì)與流動相或與凝膠介質(zhì)相互作用的干擾。一些不帶電荷的中性蛋白在純水中可實現(xiàn)有效分離，而在分離一些帶電荷的蛋白質(zhì)樣品時特別要注意這一影響，一定要調(diào)整洗脫液的離子強度，排除離子吸附等干擾。例如，Tandex因含有羧基基團，呈弱酸性，所以在用該類凝膠進行色譜操作時常使用一定離子強度的鹽溶液 （一般高于0.05）作為洗脫液，這樣就可以避免Tandex與堿性蛋白發(fā)生吸附。在分離純化蛋白質(zhì)時一般使用20-100mmol/L NaCl作為鹽溶液。但應(yīng)注意如果鹽濃度過高，會引起凝膠柱床體積的變化。

由于在凝膠過濾色譜中所用的平衡液和洗脫液一致，故在整個操作中pH不發(fā)生變化，選用具有一定緩沖能力的緩沖液即可達到控制pH的目的。維持洗脫液一定的pH，一方面是考慮蛋白質(zhì)樣品的穩(wěn)定性和溶解性，需盡量避開靠近蛋白樣品等電點的pH范圍，以防蛋白質(zhì)沉淀。另一方面，平衡、洗脫中pH的變化會造成凝膠床體積的變化，影響分離純化的效率和效果。所以在確定pH時要考慮蛋白質(zhì)樣品性質(zhì)和凝膠所能耐受的pH范圍這兩方面的因素。pH一般控制在6-8，磷酸鹽和Tris-HCl緩沖液的使用較多。生產(chǎn)商家提供的一些凝膠所適合使用的pH范圍可供參考。

溶質(zhì)的大小和分子量主要取決于分子形狀，洗脫液中所溶解的蛋白質(zhì)具有各種不同的分子形狀 （如球蛋白、微不對稱球蛋白、含纖維桿狀蛋白和變性后的彎曲結(jié)構(gòu)等），而在理想的凝膠過濾色譜中，蛋白質(zhì)為球形分子，在柱內(nèi)的保留時間僅與其分子大小和凝膠孔徑大小之間的差別有關(guān)，所以不同形狀的蛋白質(zhì)分子對分離也有不同程度的影響。在測定一些非球形蛋白質(zhì)分子量的實驗過程中，通常在樣品中加入高濃度的變性劑 （如8mol/L尿素），使各蛋白組分發(fā)生卷曲后，分子形狀趨于一致。

除以上因素之外，操作溫度、凝膠顆粒的種類和直徑、柱子的長度和內(nèi)徑等都對蛋白質(zhì)樣品的分離效果有影響。在操作過程中保持合適的溫度對分離非常重要，操作溫度要 控 制 在凝膠的zui適用范圍內(nèi)，否則會影響到凝膠分級范圍、排阻極限的準(zhǔn)確性和柱床體積的變化。

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