液相色譜，你問我答（十四）

什么是液相系統的梯度滯留體積？

它對分析有什么影響？

答：梯度滯留體積是梯度混合點到柱子進口之間的體積。這個體積導致梯度有一定延遲，因而也叫做梯度延遲體積。

現在很多液相系統都是單泵低壓梯度系統，就是說梯度是在泵的上游混合 的。梯度延遲體積的第一個部分是梯度混合器的體積。這樣，你就要加上梯度混 合器和泵頭之間的連接體積。第二個是泵頭的體積，然后是進樣器的連接管路。通常，這個體積增大一點來充分混勻流動相而使梯度平滑一點。進樣器到進樣器 和柱頭之間的體積是另一個部分。看看在通常的低壓梯度系統中，梯度滯留的地 方相當多…

也可以再高壓一邊產生梯度。這最少需要2個泵，可以盡量減少梯度延遲體積。但是高壓梯度系統不是這樣設置的。通常，連接位置在進樣器之前。好處是樣品不管怎么樣都能進入柱子，而不用依賴哪個泵的流速。最好是用初始流動相來溶解樣品，這樣梯度延遲體積可以*不記了。這個技術的一個小缺點就是樣品會被流動相的第二個組分稀釋一點點，但是如果初始流動相是90%的流動相A的話這個問題就很小了，只稀釋了10%。另一個問題是通常大部分峰會聚集在柱頭，這樣在開始的等度洗脫中只有一小部分峰被洗脫下來。這時，我們要確保進樣器與柱頭之間的體積要足夠小。高壓梯度系統就沒有這種問題。

下面我們來討論一下梯度延遲體積怎樣影響分析！由于梯度到達柱子需要時間，因此梯度一開始就延遲了，開始這段時間就是跑等度。第一個影響就是前面 的峰換個系統后保留時間可能就不一樣了。如果梯度延遲時間比較明顯，那么色譜圖中前期的峰就會明顯不同，而梯度后期則與延遲體積不怎么相關。但是洗脫時間還是會隨梯度延遲時間改變。這些情況都很讓人頭疼。這就是為什么在QC實驗室中避免使用梯度的原因。畢竟樣品時通過保留時間來定性的，如果換儀器后保留時間不一樣，那么就不好判斷了。當然也可以通過標準品的保留時間來判斷，但是還是不叫復雜….

我同意，那確實有點復雜，但也不是

無法克服的。還有其他要考慮的嗎？

答：如果在低壓系統中混合體積較大，那么你觀察到的梯度圖譜不會很尖銳。這通常不會影響標準線性梯度，但是如果是階梯狀的梯度就會影響洗脫了。通常用延遲體積小的梯度系統，現在很多HPLC系統的梯度延遲都很小。對于循環時間小的非常快速的梯度，即使延遲體積再小也不夠。這時可以采 用延遲進樣技術。理論上，梯度還是按通常的運行，但是直到梯度到達進樣器時才進樣。這樣就想沒有梯度延遲體積一樣。當然進樣環以及進樣器到柱頭的管路的體積還是有一定的延遲，但是小的可以忽略了。

當梯度運行完后，柱子會重新開始平衡，也是有延遲。所以我們不用等到柱子重新平衡好后再開始新的梯度，我們只要知道設計的程序，泵的運行與柱頭實際發生的不一樣就行了。梯度運行和柱子再平衡被排空梯度延遲體積抵消了。這個解決方法讓我們可以在單泵系統中實施沒有延遲的快速梯度。另外，如果在不同的儀器上運行同樣的梯度，延遲體積造成的影響會很小。這樣我們就可以在不同的儀器上重復梯度。當然，以上都是假設梯度發生器穩定工作，可重復并且能確實按要求工作。

怎么測量梯度延遲體積呢？

怎么確定系統的梯度確實是想要的呢？

答：有個標準測試非常有用，參考《JJG 705 2014液相色譜儀檢定規程》中對梯度檢定的部分。不接柱子，在流動相B中加少量的UV吸收劑0.1%丙酮，然后運行梯度。這可以觀察真實的梯度。從程序與實際的差別中可以檢測到系統的梯度延遲體積。如果你采用延遲進樣，你就必須要了解這點。對系統了解的越多，在梯度分析中浪費的時間就會越小。